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纳豆激酶检测

纳豆激酶检测

发布时间:2025-08-06 12:20:30

中析研究所涉及专项的性能实验室,在纳豆激酶检测服务领域已有多年经验,可出具CMA和CNAS资质,拥有规范的工程师团队。中析研究所始终以科学研究为主,以客户为中心,在严格的程序下开展检测分析工作,为客户提供检测、分析、还原等一站式服务,检测报告可通过一键扫描查询真伪。

纳豆激酶检测:活性、安全与纯度管控的关键密码

纳豆激酶,源于日本传统发酵食品纳豆中的一种具有强大纤溶活性的蛋白酶,因其潜在的心血管健康益处而风靡全球保健食品和医药原料市场。然而,其功效的发挥高度依赖于产品的活性强度、安全性和纯度。因此,建立科学、严谨的纳豆激酶检测体系,成为保障产品质量、维护消费者权益、推动行业健康发展的核心技术支撑。本文将深入解析纳豆激酶检测的核心项目、主流标准与关键方法。

一、 核心检测项目

纳豆激酶的检测是一个多维度的质量评价过程,主要涵盖以下核心类别:

  1. 酶活性检测 (核心指标):

    • 纤溶活性 (Fibrinolytic Activity): 这是纳豆激酶最核心的功能性指标,直接反映其溶解血栓(纤维蛋白凝块)的能力。活性单位通常以 纤维蛋白溶解单位 (FU - Fibrinolytic Units)国际单位 (IU - International Units) 表示。
    • 测定意义: 是产品标示功效、比较不同产品效能、控制生产工艺稳定性的根本依据。
  2. 安全性检测 (必需保障):

    • 微生物限量: 严格检测产品中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌和指示菌,确保产品卫生安全。符合食品或药品的微生物学要求。
    • 重金属: 检测铅 (Pb)、砷 (As)、汞 (Hg)、镉 (Cd) 等有毒重金属残留,防止环境污染或生产过程中引入的风险。
    • 黄曲霉毒素 B1 (Aflatoxin B1): 若原料为大豆,需检测由霉菌产生的强致癌物黄曲霉毒素 B1。
    • 农药残留: 对原料大豆中可能残留的农药进行筛查。
    • 溶剂残留: 如果生产工艺涉及有机溶剂提取或纯化,需检测溶剂残留量(如乙醇、乙酸乙酯等)。
    • 生物胺/组胺: 发酵过程中可能产生生物胺,尤其是组胺,需控制其含量避免过敏风险。
  3. 纯度与特性检测 (质量控制):

    • 外观与性状: 颜色、气味、状态(粉末、液体等)。
    • 水分/干燥失重: 对于粉末产品,控制水分含量以保证稳定性和活性。
    • 灰分: 反映产品中无机盐的总含量。
    • 蛋白质含量/纯酶含量: 通过凯氏定氮法、Lowry 法、BCA 法或紫外分光光度法 (A280nm) 测定总蛋白质含量。结合活性数据可计算比活 (Specific Activity, FU/mg protein 或 IU/mg protein),是衡量酶纯度和催化效率的关键指标。
    • 分子量确认: 采用 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳) 分析,确认主成分是否为约 27-28 kDa 的纳豆激酶单体,并检查是否有杂蛋白或降解片段。
    • 等电点测定 (可选): 有助于确认酶的电荷特性。
 

二、 遵循的检测标准

纳豆激酶的检测依据通常参考以下几个层面的规范和公认方法:

  1. 国际/行业通用标准与方法学文献:

    • 纤维蛋白平板溶解法 (Fibrin Plate Method): 这是目前国际上最广泛接受和认可的测定纳豆激酶纤溶活性的经典方法,被大量研究文献和行业实践采用。其原理和操作细节是事实上的“金标准”。
    • 日本纳豆激酶协会 (Japan Natto Kinase Association, JNKA) 标准: JNKA 对其认证的产品制定了活性单位 (FU) 的定义、检测方法细则以及每日推荐摄入量标准 (2000 FU)。该标准在行业内具有重要影响力。
    • 国际生化联合会 (IUBMB) 酶学委员会方法: 虽无纳豆激酶专属条目,但其酶活性测定的一般原则和方法验证要求具有指导意义。
    • 药典通则方法: 对于安全性检测(微生物、重金属、水分、灰分等),普遍参考:
      • 《中华人民共和国药典》 (ChP): 通则项下的相关检测方法(如 <1105> 非无菌产品微生物限度检查, <0821> 水分测定法, <0822> 炽灼残渣检查法, <2321> 重金属检查法等)。
      • 《美国药典》 (USP) / 《欧洲药典》 (Ph. Eur.): 相应的通则方法。
  2. 国家标准/行业规范:

    • 中国相关的食品安全国家标准 (GB系列),如:
      • GB 4789 系列 (食品安全国家标准 食品微生物学检验)
      • GB 5009 系列 (食品安全国家标准 食品中污染物限量及检测方法, 如铅、砷、汞、镉)
      • GB 5009.22 (食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定)
      • GB 5009.262 (食品中溶剂残留量的测定) 等。
    • 相关的保健食品或原料的质量标准/技术规范(若有)。
  3. 企业内控标准:

    • 生产企业会根据自身产品定位、生产工艺和客户要求,制定严于或补充通用标准的更严格的企业内控质量标准,明确各项指标的合格范围。
 

三、 关键检测方法详解

  1. 纤溶活性测定 - 纤维蛋白平板溶解法:(核心金标准)

    • 原理: 在琼脂糖平板上均匀铺布含有纤维蛋白原和凝血酶的混合液,形成不透明的纤维蛋白凝胶层。将不同浓度的纳豆激酶样品溶液(或标准品溶液)加到凝胶表面的小孔中。在适宜温度(通常 37°C)下孵育一段时间(通常 18-24 小时)。纳豆激酶扩散到凝胶中并水解纤维蛋白,在样品孔周围形成透明的溶解圈。
    • 定量: 精确测量溶解圈的直径(或面积)。以标准品(已知 FU 或 IU)的浓度(或对数浓度)为横坐标,溶解圈面积为纵坐标,绘制标准曲线。根据待测样品的溶解圈面积,在标准曲线上查出其对应的活性单位浓度,乘以稀释倍数即得样品活性(FU/mL 或 FU/g)。
    • 关键点: 纤维蛋白原和凝血酶的浓度、琼脂糖浓度、孵育温度和时间的严格控制至关重要,直接影响结果的重现性和可比性。单位定义需明确(如:在特定条件下,产生特定大小溶解圈所需的酶量定义为 1 FU)。
  2. 酶活性测定 - 合成底物法:(快速筛选/辅助)

    • 原理: 使用人工合成的、对纳豆激酶特异(或相关丝氨酸蛋白酶)的显色肽底物(如 H-D-Val-Leu-Lys-pNA, S-2251)。纳豆激酶水解底物释放出黄色的对硝基苯胺 (pNA)。
    • 定量: 在特定波长(通常是 405 nm)下监测 pNA 吸光度的上升速率(ΔA/min),该速率与酶活性成正比。通过与标准曲线比较计算活性。
    • 特点: 操作相对快速、自动化程度高、通量大、精密度好。但结果与最终的纤溶功效(溶解真实纤维蛋白凝块的能力)的相关性有时不如平板法直接,可能受底物特异性影响。常用于生产过程中的快速监控或初筛,但最终产品或重要研究常需结合或验证平板法的结果。
  3. 安全性检测方法:

    • 微生物检测: 严格按照 GB 4789 系列(或 USP <61>/<62>, Ph. Eur. 2.6.12/2.6.13)规定的方法进行样品前处理、培养、计数和鉴定。
    • 重金属检测: 主要采用原子吸收光谱法 (AAS),特别是石墨炉原子吸收光谱法 (GFAAS) 测定铅、镉;采用原子荧光光谱法 (AFS) 或电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS) 测定砷、汞。也可参考药典通则方法。
    • 黄曲霉毒素 B1: 主要采用高效液相色谱法 (HPLC) 结合荧光检测器 (FLD) 或串联质谱 (LC-MS/MS) 进行检测。
    • 农药残留: 通常采用气相色谱法 (GC) 或液相色谱法 (LC) 结合质谱 (GC-MS/MS, LC-MS/MS) 进行多残留分析。
    • 溶剂残留: 主要采用顶空气相色谱法 (HS-GC) 或 GC-MS。
    • 生物胺/组胺: 常用 HPLC 结合紫外或荧光检测器,或 LC-MS/MS 进行测定。
  4. 纯度与特性检测方法:

    • 蛋白质含量: Lowry 法、BCA 法、Bradford 法或紫外分光光度法 (A280nm)。凯氏定氮法用于总氮/粗蛋白测定。
    • 水分: 常压干燥法、减压干燥法或卡尔费休法(Karl Fischer Titration)。
    • 灰分: 高温灼烧法。
    • 分子量 (SDS-PAGE): 样品经变性处理后,在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,与蛋白质分子量标准品对照,染色(如考马斯亮蓝)后观察主条带位置,确认是否为预期分子量 (~28 kDa)。
    • 等电点 (IEF): 利用等电聚焦电泳分离蛋白质,根据其等电点 (pI) 的不同进行分离和测定。
 

四、 质量标准与展望

一份合格的纳豆激酶原料或产品的质量标准应明确规定上述关键检测项目的合格限值。例如:

  • 活性 (FU/g): 根据产品规格设定(如 ≥ 10, 000 FU/g, ≥ 20, 000 FU/g 等)。
  • 安全性: 微生物指标必须符合相应类别(食品、保健食品、药品原料)的国家标准或药典规定;重金属、黄曲霉毒素等污染物的限量通常严于普通食品标准。
  • 纯度: 蛋白质含量(如 ≥ 80%)、水分(如 ≤ 8.0%)、灰分(如 ≤ 5.0%)、杂质限度等。
  • 比活 (FU/mg protein): 反映酶制剂的催化效率和纯度,是核心质量指标之一。
 

随着技术进步,纳豆激酶的检测方法也在不断发展。更快速、灵敏、高通量的合成底物法及其自动化应用在扩大;基于质谱的精准定量方法(如利用特征肽段进行绝对定量)在研究和质量控制中展现出潜力;对活性构象、稳定性以及体内真实生物利用度和功效的评估方法也是未来的重要研究方向。

结论

纳豆激酶的检测是一项融合生物学、化学和分析技术的系统性工程。以纤维蛋白平板法为核心的酶活性检测,结合严格的安全性监控和全面的纯度特性分析,共同构成了纳豆激酶产品质量保障的基石。严格遵守国际公认方法和相关国家标准/药典要求,并建立科学的企业内控标准,是确保纳豆激酶产品安全、有效、高品质的关键所在,对于维护消费者健康、提升行业信誉、促进纳豆激酶产业的可持续发展具有不可替代的作用。随着科学研究的深入和检测技术的革新,纳豆激酶的质控体系将更加完善和精准。

附录:纳豆激酶核心检测项目概览表

检测类别 核心项目 主要检测方法/标准 关键意义 典型单位/表示
酶活性 纤溶活性 纤维蛋白平板溶解法 (金标准)
合成底物法 (辅助/快速)
核心功能性指标 FU (Fibrinolytic Units)
IU (International Units)
安全性 微生物限量 GB 4789系列 / USP <61>/<62> / Ph.Eur. 2.6.12/2.6.13 确保产品卫生 CFU/g (菌落形成单位/克)
(必需保障) 重金属 (Pb, As, Hg, Cd等) AAS, GFAAS, AFS, ICP-MS / ChP, USP通则 防止有毒元素污染 mg/kg (毫克/千克)
  黄曲霉毒素B1 HPLC-FLD, LC-MS/MS 防止强致癌物污染 (原料相关) µg/kg (微克/千克)
  农药残留 GC-MS/MS, LC-MS/MS 控制农业化学品残留 mg/kg (毫克/千克)
  溶剂残留 HS-GC, GC-MS 控制生产工艺残留 mg/kg (毫克/千克)
  生物胺/组胺 HPLC, LC-MS/MS 防止发酵副产物引起过敏风险 mg/kg (毫克/千克)
纯度与特性 蛋白质含量/纯酶含量 Lowry法, BCA法, Bradford法, UV280nm, 凯氏定氮 计算比活的基础指标 % (百分比), mg/g (毫克/克)
(质量控制) 比活 纤溶活性 / 蛋白质含量 核心质量指标,反映纯度和催化效率 FU/mg protein (FU/毫克蛋白)
  分子量确认 SDS-PAGE 确认主成分及杂质 kDa (千道尔顿)
  水分/干燥失重 常压/减压干燥法,卡尔费休法 / ChP, USP通则 保证稳定性 % (百分比)
  灰分 高温灼烧法 / ChP, USP通则 反映无机盐总量 % (百分比)
  外观与性状 目视观察 基本物理特性 描述性 (如:白色至淡黄色粉末)
  等电点 (可选) 等电聚焦电泳 (IEF) 确认电荷特性 pH单位
检测资质
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