酵母菌和霉菌总数检测

酵母菌和霉菌总数检测指南

检测意义与定义
酵母菌和霉菌是环境中广泛存在的微生物，在食品、药品、化妆品及环境中普遍存在。它们在一定条件下可导致产品腐败变质、产生毒素或引发健康问题。酵母菌和霉菌总数检测旨在定量测定样品中可培养的酵母菌和霉菌的总活菌数（通常以CFU/g或CFU/mL表示）。该指标是评估产品质量、卫生状况、安全性和保质期的重要微生物学参数。

核心检测原理
检测基于微生物培养计数法：

1. 样品处理与稀释： 将代表性样品在无菌条件下处理（如均质、研磨）并制备成均匀的初始悬液，随后进行一系列10倍梯度稀释，以获取适宜计数的浓度。
2. 选择性培养： 选择适合酵母菌和霉菌生长并能抑制细菌过度生长的培养基（常用含抗生素如氯霉素或金霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基）。将特定稀释度的样品悬液定量（通常1mL或0.1mL）接种至无菌平皿中，倾注融化并冷却至约45℃的培养基，混匀。
3. 适宜培养： 待琼脂凝固后，将平板倒置于恒温培养箱中。酵母菌和霉菌通常在20-25°C下培养5-7天（部分方法或标准可能要求培养3天后初步观察，5天最终计数）。
4. 菌落识别与计数： 培养结束后，计数平板上形成的典型酵母菌和霉菌菌落总数。酵母菌菌落通常呈乳白色、奶油色或粉红色，湿润光滑，边缘整齐。霉菌菌落形态多样，呈绒毛状、絮状、蛛网状或颗粒状，颜色丰富（绿、黑、黄、褐等）。注意区分蔓延生长的菌落（可能仅计为一个菌落或分割计数）。
5. 结果计算： 选择菌落数在15-150 CFU之间的平板进行计数（理想范围）。根据稀释倍数和接种量计算出每克（或每毫升）原始样品中的酵母菌和霉菌总数（CFU/g 或 CFU/mL）。

关键操作步骤详解

1. 前期准备：
   • 培养基制备与灭菌：按照标准配制培养基，灭菌后保温备用。
   • 仪器灭菌：所用玻璃器皿、吸管、均质袋、均质杯等均需灭菌。
   • 样品接收与登记：核对样品信息，检查包装完整性。
2. 样品处理：
   • 无菌操作打开样品包装。
   • 固体/半固体样品： 无菌称取规定量（通常25g）加入含225mL无菌稀释液（如0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲液）的均质袋或均质杯中，均质1-2分钟，制成1:10的初始悬液。
   • 液体样品： 无菌量取样品25mL加入含225mL无菌稀释液的瓶中，混匀成1:10初始悬液；或直接使用原液作为初始稀释度。
   • 表面涂抹样品： 将涂抹后拭子置于定量稀释液中充分振荡洗脱。
3. 梯度稀释： 用无菌吸管吸取1:10初始悬液1mL加入到9mL无菌稀释液中，充分混匀，制成1:100（10^-2）稀释液。依此进行后续10倍梯度稀释（如10^-3, 10^-4等），根据样品预估污染程度选择合适的2-3个稀释度进行后续接种。
4. 倾注接种：
   • 对选定的每个稀释度，分别取1mL（或0.1mL，需注明）样液加入到两个无菌平皿中（平行样）。
   • 每个平皿中迅速倾注约15-20mL已融化并冷却至45±1℃的特定培养基（如马铃薯葡萄糖琼脂+氯霉素）。
   • 立即在水平台面上轻轻旋转平皿，使样液与培养基充分混匀。避免培养基溅到皿盖上。
5. 恒温培养： 待琼脂完全凝固（约10-15分钟），将平板倒置放入恒温培养箱中，在20-25°C下培养5-7天。期间避免频繁开启培养箱。
6. 菌落计数：
   • 培养结束后，立即计数。选择菌落分散良好、数量在15-150 CFU之间的平板进行计数。
   • 肉眼观察，必要时使用菌落计数器或放大镜辅助。
   • 区分酵母菌菌落（通常较小、光滑、湿润）和霉菌菌落（通常较大、呈丝状、干燥）。
   • 对于蔓延生长的霉菌菌落：
     • 若蔓延面积小于平皿面积的1/2，且其余部分菌落分布均匀，可计数蔓延菌落覆盖的区域视为1个菌落，加上其他区域菌落数。
     • 若蔓延面积过大，只计数未被蔓延区域内的菌落数，或报告为“菌落蔓延”。
   • 记录每个有效稀释度的平板菌落数。
7. 结果报告：
   • 计算公式：
     • 固体/半固体：酵母菌和霉菌总数(CFU/g) = 平板平均菌落数 × 稀释倍数 / 接种量(mL) * 初始悬液体积(mL) / 样品重量(g)
     • 液体：酵母菌和霉菌总数(CFU/mL) = 平板平均菌落数 × 稀释倍数 / 接种量(mL)
     • 若接种量为0.1mL，则公式中需额外乘以10。
   • 报告方式：
     • 选择计算结果在30-300 CFU之间的稀释度进行计算报告。
     • 若所有稀释度平板菌落数均小于15，报告最低稀释度的平板菌落数的估计值（乘以相应稀释倍数）。
     • 若所有稀释度平板均无菌落生长，报告为 < 1 × 最低稀释倍数 (CFU/g 或 CFU/mL)。
     • 若最低稀释度平板菌落数超过150，报告为最高稀释度的平板菌落数的估计值（乘以相应稀释倍数），或注明“估计值”。
   • 最终结果通常保留两位有效数字，并用科学计数法表示（如 1.5 × 10^3 CFU/g）。

结果解读与注意事项

• 结果含义： 报告值代表在特定培养基上和规定条件下，每克或每毫升样品中生长出来的酵母菌和霉菌菌落形成单位的总数。数值越高，表明样品受酵母菌和霉菌污染的程度越严重。
• 标准依据： 结果判定必须参照适用的产品国家标准、行业标准或企业内部标准限值。
• 局限性： 该方法仅反映在所选培养基和培养条件下生长的那部分酵母菌和霉菌。某些受损细胞、特殊营养需求的菌种或专性厌氧菌可能无法检出。
• 关键注意事项：
  • 无菌操作： 全过程必须在洁净环境（如超净工作台）中严格进行无菌操作，防止外部污染。
  • 样品代表性： 取样需具有代表性，处理过程避免污染或微生物死亡。
  • 培养基质量控制： 使用前确认培养基无菌、无污染，并符合标准要求（如质控菌株测试）。
  • 稀释均匀性： 每次稀释必须充分混匀，保证微生物细胞分布均匀。
  • 接种量准确： 使用校准过的移液器准确吸取样液。
  • 培养温度与时间： 严格控制培养温度和时间，这对结果准确性至关重要。避免温度波动。
  • 菌落鉴别： 准确识别酵母菌菌落和霉菌菌落是正确计数的前提。需要经验积累。
  • 蔓延菌落处理： 严格按照标准规范处理蔓延菌落，避免计数错误。
  • 及时计数： 培养结束后尽快计数，以免菌落继续生长或干枯影响判断。

质量控制要点

• 空白对照： 每批次检测应同时设置培养基空白对照（无菌水代替样液）和/或环境空白（开盖暴露一段时间），确保培养基无菌且操作环境洁净。
• 阳性对照： 定期使用标准菌株（如黑曲霉、白色念珠菌）进行测试，验证培养基的促生长能力和选择性。
• 平行试验： 每个样品稀释度至少应做两个平行平板。
• 人员培训与比对： 操作人员需经专业培训，定期进行人员间或实验室间比对，保证计数的一致性与准确性。
• 仪器校准： 定期对关键设备（如天平、培养箱、移液器）进行校准。

通过遵循标准化的操作流程、严格控制实验条件、实施有效的质量控制措施，酵母菌和霉菌总数检测能够为评估产品微生物安全性、稳定性及生产过程卫生控制提供可靠的数据支持。