香精致敏性体外筛查

香精致敏性体外筛查技术综述

1. 检测项目：方法学与原理

香精致敏性体外筛查的核心在于评估香料物质与皮肤致敏关键生物事件（关键事件，KE）的相互作用，主要聚焦于与蛋白质共价结合（亲电性）和诱发皮肤细胞炎症反应的能力。

1.1 直接肽反应试验

• 原理：模拟致敏原与皮肤蛋白质的分子起始事件。将待测香料物质与含有亲核氨基酸（如赖氨酸、半胱氨酸）的合成肽共孵育，通过高效液相色谱-质谱联用技术定量分析肽的被修饰程度。该方法是评估化学物质亲电反应活性（关键事件1）的基石。

• 方法：主要分为两种：测定半胱氨酸反应性的DPRA和测定赖氨酸反应性的类似方法。通常将两者结果结合，进行分类判断。

1.2 基于细胞系或原代细胞的体外试验

• 原理：评估香料物质诱发角质形成细胞或树突状细胞炎症反应及激活相关通路的能力（关键事件2和3）。

  • ARE-Nrf2荧光素酶报告基因试验：利用经过工程改造的角质形成细胞系，其含有抗氧化反应元件驱动的荧光素酶报告基因。当香料物质激活细胞内Nrf2通路（应对亲电应激的防御通路）时，荧光素酶表达显著增加，可通过化学发光法精确定量，该信号与致敏潜能高度相关。

  • 人细胞系活化试验：采用人源性单核细胞来源的树突状细胞系或THP-1细胞系。通过检测细胞表面共刺激分子（如CD86、CD54）的表达上调，或细胞因子（如IL-8）的分泌增加，来评估香料物质的免疫激活潜能。该方法模拟了皮肤致敏过程中抗原呈递细胞的成熟过程。

  • IL-18报告基因试验：基于HaCaT角质形成细胞系构建，表达IL-18受体和报告基因。当致敏原刺激细胞产生内源性IL-18并自分泌作用于受体时，触发报告基因信号，特异性地反映致敏相关的炎症反应。

1.3 体外皮肤模型致敏试验

• 原理：使用重建的人表皮模型，在更接近人体皮肤生理结构的体系中进行评估。将香料物质局部作用于三维表皮模型，暴露一定时间后，检测模型液中生物标志物的释放。

  • 检测标志物：通常包括IL-18和IL-1α等。IL-18被认为是区分致敏原和刺激物的关键细胞因子之一。该方法整合了化学物质穿透表皮屏障、与角质形成细胞相互作用并引发炎症信号等多个过程，提供了更高的生理相关性。

2. 检测范围：应用领域的检测需求

• 化妆品及个人护理品原料与终产品安全性评估：这是最主要的应用领域。为确保产品安全性，新开发的香料单体或复杂香精需通过体外筛查评估其致敏风险，用于原料筛选、配方支持及上市前安全评估。

• 医药产品：外用药品（如软膏、贴剂）中添加的芳香成分需进行致敏性评估，以降低患者发生接触性皮炎的风险。

• 工业与日用化学品：洗涤剂、织物柔顺剂、空气清新剂等产品中使用的香精，因可能通过皮肤接触或吸入暴露，需要进行相关风险评估。

• 新化学物质注册与法规遵从：根据相关法规，如欧盟的REACH法规，新生产的或进口的香料化学物质在达到一定吨位时，需提供皮肤致敏性数据。体外测试是满足该数据需求的关键非动物方法。

• 科学研究与机理探索：用于研究香料致敏的分子机制、结构-活性关系，以及开发新的预测模型或生物标志物。

3. 检测标准：主要参考文献框架

国际上的监管和科学共识已形成以“不利结局通路”（AOP）为基础的整合测试与评估策略。

在香料致敏性体外评估领域，多项研究为方法的建立和验证提供了关键依据。一项发表于《毒理学体外》杂志的研究系统地描述了直接肽反应试验的原理与标准化操作规程，奠定了反应活性检测的基础。对于细胞活化试验，发表在《应用毒理学》杂志上的研究详细比较了基于不同细胞系和标志物的方法在区分致敏物与非致敏物方面的性能。关于三维皮肤模型的应用，一篇发表于《过敏与临床免疫学》杂志的文献重点阐述了IL-18作为预测性生物标志物在重建人表皮模型中的有效性和特异性。

此外，经济合作与发展组织发布的多份测试指南文件，为上述关键体外方法的国际间标准化应用提供了技术框架。这些指南基于大量的验证研究数据，规定了试验的适用范围、操作流程、数据接受标准和结果解释标准，是方法被监管机构采纳的重要依据。

4. 检测仪器：主要设备及其功能

• 高效液相色谱-质谱联用仪：用于直接肽反应试验的核心设备。HPLC分离反应混合物中的肽及其加合物，MS（特别是串联质谱MS/MS）提供精确的分子量鉴定和定量信息，实现对肽修饰程度的精准分析。

• 酶标仪（多功能微孔板检测仪）：配备化学发光、荧光和吸光度检测模块。用于读取ARE-Nrf2报告基因试验的化学发光信号、某些细胞活性或毒性检测的荧光或吸光度信号，以及ELISA法检测细胞因子（如IL-8, IL-18）的吸光度信号。是细胞学试验的必备仪器。

• 流式细胞仪：用于人细胞系活化试验。精确、高通量地检测经香料物质刺激后，细胞表面标志物（如CD86、CD54）的表达水平变化，进行免疫表型分析。

• 实时荧光定量PCR仪：可作为补充手段，用于检测香料物质暴露后，细胞内源性基因（如Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1，或炎症因子基因）的mRNA表达水平变化，从转录水平验证其生物活性。

• 细胞培养相关设备：包括二级生物安全柜（用于无菌操作）、二氧化碳培养箱（维持细胞生长环境）、倒置显微镜（观察细胞形态）和自动化细胞计数器（快速准确计数细胞），是所有基于细胞试验的基础支撑平台。

• 皮肤模型培养与处理系统：包括用于维持重建表皮模型的专用培养装置、精确的样品局部加样设备（如微量移液器或专用敷贴器）以及用于收集模型液的设备，确保三维皮肤模型试验的规范性。