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一、检测原理

致敏性检测的核心科学依据是免疫学反应，旨在识别和量化物质引发机体I型超敏反应（即速发型过敏反应）的潜能。其基本原理可分为体内、体外及体外-计算机结合三类。

体内检测原理：
- 局部淋巴结试验（LLNA）：是目前首选的体内方法。其原理是，致敏原被表皮朗格汉斯细胞捕获并提呈给T淋巴细胞，导致引流淋巴结中T淋巴细胞活化和增殖。通过检测淋巴结细胞增殖程度（通常以放射性胸苷掺入量或其它替代标志物如ATP含量来衡量），定量评估受试物的致敏强度。与传统豚鼠试验（如GPMT、Buehler试验）相比，LLNA具有客观定量、减少动物痛苦、灵敏度高等优点。
- 豚鼠试验：作为传统方法，其原理是通过重复皮肤暴露（皮内注射或表皮涂抹）使动物致敏，经过一段潜伏期后，再次给予激发剂量，观察是否出现红斑、水肿等皮肤过敏反应。其依据是受试物作为半抗原与皮肤蛋白结合形成完全抗原，从而激活免疫系统。
体外检测原理：
- 直接肽反应试验（DPRA）：模拟化学物质与皮肤蛋白共价结合的关键分子起始事件。该试验将受试物与含有赖氨酸和半胱氨酸的合成肽共同孵育，通过高效液相色谱（HPLC）测定肽的消耗率。消耗率越高，表明受试物与蛋白质结合能力越强，致敏风险越高。
- 人细胞系活化试验（h-CLAT）：模拟树突状细胞活化的关键细胞事件。该试验使用人源树突状细胞系（如THP-1或U937），将细胞与受试物共孵育后，通过流式细胞术检测细胞表面CD86和CD54标志物的表达上调情况。这些标志物的表达增加是T细胞活化所必需的共刺激信号。
- KeratinoSens™ / LuSens试验：模拟皮肤角质形成细胞的应激反应。这些试验利用转基因报告基因细胞系，检测受试物是否能激活抗氧化反应元件（ARE）通路，该通路与许多致敏原引发的细胞防御机制相关。报告基因（如荧光素酶）的表达量反映了通路的激活程度。
计算机预测（in silico）原理：
- 基于定量构效关系（QSAR）模型。通过分析已知致敏物的化学结构特征（如官能团、分子量、疏水性等），建立化学结构特征与致敏潜能之间的数学模型，用于预测新化合物的致敏性。

二、检测项目

致敏性检测项目可根据测试体系和应用目的进行系统分类。

按测试体系分类：
- 体内试验：局部淋巴结试验（LLNA）、豚鼠最大值试验（GPMT）、Buehler封闭贴敷试验。
- 体外试验：
  - 基于分子事件的检测：直接肽反应试验（DPRA）、氨基酸衍生物反应性试验（ADRA）。
  - 基于细胞事件的检测：人细胞系活化试验（h-CLAT）、U937细胞系活化试验（U-SENS）、树突状细胞活化标志物检测。
  - 基于关键信号通路激活的检测：KeratinoSens试验、LuSens试验。
- 计算机预测：基于规则的专家系统、统计学的QSAR模型。
按应用目的分类：
- 危害识别：定性判断物质是否具有致敏性。
- potency分级：定量或半定量评估致敏性的强弱，通常用于化学品分类与标签（如GHS分类：1A强致敏物，1B其他致敏物）。
- 风险评估：结合暴露评估数据，定量评估对人体产生过敏反应的实际风险。
- 产品安全性评价：针对最终产品（如化妆品、医疗器械）进行的整体致敏性评估。

三、检测范围

致敏性检测广泛应用于各行业，以确保产品安全和合规。

化妆品及个人护理品：检测香料、防腐剂、染发剂、防晒剂等原料及终产品的皮肤致敏性。欧盟化妆品法规（EC No 1223/2009）等明确禁止对化妆品成品进行动物试验，极大推动了体外检测方法的应用。
化学品：根据欧盟REACH法规、全球化学品统一分类和标签制度（GHS）等，对产量/进口量达到一定吨位的化学物质必须进行皮肤致敏性评估和分类。
医疗器械：根据ISO 10993系列标准，与人体接触时间超过24小时的医疗器械（如植入物、导管、敷料）及其材料需进行致敏性评价，通常采用豚鼠最大化试验或LLNA。
药品：评估原料药、辅料及制剂在非临床研究阶段的潜在致敏性，是药物安全性评价的一部分。
食品及食品接触材料：评估新资源食品、食品添加剂以及食品包装材料中可能迁移出的物质是否具有致敏性。
纺织、染料及玩具：检测纺织品中残留的染料、整理剂，以及玩具材料中的化学物质，确保其不会引起儿童或使用者皮肤过敏。

四、检测标准

国内外标准组织制定了多项致敏性检测指南，其在方法接受度和适用范围上存在差异。

标准体系	标准编号/名称	主要方法	特点与适用范围
经济合作与发展组织 (OECD)	OECD TG 406 (豚鼠试验)	GPMT, Buehler Test	传统动物试验，目前仍被广泛接受作为参考方法。
	OECD TG 429 (LLNA)	放射性LLNA	首选的体内定量方法，使用放射性标记。
	OECD TG 442A	非放射性LLNA (如DA, BrdU-ELISA)	LLNA的替代方法，避免使用放射性物质。
	OECD TG 442C	直接肽反应试验 (DPRA)	评估化学物质与肽的反应性（分子起始事件）。
	OECD TG 442D	h-CLAT	评估树突状细胞活化（关键细胞事件）。
	OECD TG 442E	KeratinoSens试验	评估角质形成细胞ARE通路的激活。
欧盟	EU B.42 (REACH)	LLNA	REACH法规下认可的皮肤致敏性测试方法。
	EU B.42 (REACH)	DPRA, h-CLAT等	认可使用体外方法进行致敏性评估。
美国	US EPA OPPTS 870.2600	皮肤致敏试验	用于农药和有毒物质评估，接受豚鼠法和LLNA。
国际标准化组织 (ISO)	ISO 10993-10	GPMT, LLNA	医疗器械生物学评价中致敏试验的专用标准。
中国	GB/T 16886.10	GPMT, LLNA	等同采用ISO 10993-10，用于医疗器械评价。
	《化妆品安全技术规范》	体内及体外方法	明确规定禁止动物试验，积极采纳和验证体外替代方法。

趋势：国际标准正从单一的体内试验向基于风险评估的整合测试策略（IATA）和定义性方法（DA）转变，强调使用多个体外和计算机方法组合来替代动物试验。

五、检测方法

直接肽反应试验（DPRA）操作要点：
- 将受试物与半胱氨酸肽和赖氨酸肽分别孵育。
- 使用HPLC分析孵育后混合物，计算肽的消耗百分比。
- 根据预定的评判标准（如半胱氨酸肽消耗率>6.38%），判断受试物的反应性。
人细胞系活化试验（h-CLAT）操作要点：
- 培养THP-1细胞，用一系列浓度的受试物处理。
- 通过流式细胞术检测细胞表面CD86和CD54的表达水平。
- 计算使标志物表达达到预定激活阈值（如相对荧光强度≥150%）的浓度（EC150），用于 potency 评估。
局部淋巴结试验（LLNA）操作要点：
- 将受试物连续三天涂抹于小鼠耳部。
- 第五天，注射放射性胸苷或其它增殖标志物。
- 取出耳部引流淋巴结，测量淋巴结细胞的增殖情况（放射性计数或替代标志物信号）。
- 计算刺激指数（SI）和引起SI≥3的最小剂量（EC3值），EC3值用于致敏强度分级。

六、检测仪器

高效液相色谱仪（HPLC）：用于DPRA等试验中肽消耗率的精确测定。要求具备高分离度、高灵敏度的紫外或荧光检测器。
流式细胞仪：是h-CLAT、U-SENS等细胞活化试验的核心设备。用于快速、多参数分析细胞表面标志物的表达。需具备稳定的液流系统和灵敏的光电检测系统。
液体闪烁计数仪/微孔板发光检测仪：用于LLNA及其替代方法中细胞增殖的定量。前者检测放射性同位素，后者检测化学发光或荧光信号。
酶标仪：用于基于ELISA的LLNA（如BrdU-ELISA）和细胞活性检测（如MTT法）。需具备吸光度、荧光和化学发光等多种检测模式。
实时荧光定量PCR仪：可用于检测细胞模型中致敏相关基因（如ARE通路下游基因）的表达变化，作为辅助分析手段。
细胞培养设备：包括CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜等，是进行所有细胞水平体外试验的基础。

七、结果分析与评判标准

定性判定：
- 体内试验（如LLNA）：通常以刺激指数（SI）≥3判定为阳性致敏物。
- 体外试验：
  - DPRA：半胱氨酸肽和/或赖氨酸肽消耗率超过设定阈值（如分别为6.38%和2.58%）。
  - h-CLAT：在细胞存活率>50%的条件下，CD86或CD54的相对荧光强度（RFI）≥150%。
  - KeratinoSens：荧光素酶活性诱导超过设定倍数（如1.5倍），且具有浓度依赖性。
定量分级（Potency）：
- 关键参数：体内试验常用EC3值（在LLNA中引起SI=3的受试物估算浓度）。EC3值越小，致敏性越强。
- GHS分类：
  - 1A子类别（强致敏物）：通常对应EC3值 ≤ 2%。
  - 1B子类别（其他致敏物）：通常对应EC3值 > 2%。
- 基于体外数据的整合策略：通过将多个体外试验（如DPRA, h-CLAT, KeratinoSens）的结果输入到预测模型或按照决策树进行整合，可以模拟出体内的致敏潜能，并进行分类。
整合测试与评估（IATA）：
现代致敏性评估不依赖于单一方法，而是采用权重证据法和整合测试策略。例如，首先使用计算机预测和DPRA评估反应性，若结果为阴性，则可能需要h-CLAT或KeratinoSens来评估细胞活化能力。只有当体外数据不充分或存在矛盾时，才考虑使用LLNA。最终结论基于所有可用数据的综合分析和科学判断。